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HPLC Grundlagen
1.0 Die HPLC
In den 1960er Jahren wurde aus der Säulenchromatographie LC mit ihren Glassäulen (Abb. 1) im Niederdruckbereich die HPLC mit Metallsäulen (Abb. 2) im Hochdruckbereich entwickelt.
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
LC = Liquid Chromatography
Die HPLC dient genauso wie die LC zur Trennung von Stoffen aus einer Probe, auch Aufreinigung oder Isolierung genannt, nur wird die Trennung mit der HPLC wesentlich schneller erledigt als mit der LC. Voraussetzung für die Flüssig Chromatographie ist, dass die Probe in einem Lösemittel gelöst vorliegt.
Die Aufreinigung findet in einer Trennsäule zwischen einer stationären und einer mobilen Phase statt. Bei dieser Art von Chromatographie ist die stationäre Phase ein körniges Material mit sehr kleinen, porösen Teilchen in einer Trennsäule (Abb. 3). Während die mobile Phase ein Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch ist, welches mit hohem Druck durch die Trennsäule gepresst wird. Über ein Ventil mit einer angeschlossenen Probenschleife (Abb. 4), einem kleinen Schlauch oder einer Kapillare aus Edelstahl, wird die Probe in den Fluss der mobilen Phase von der Pumpe zur Trennsäule mittels einer Spritze eingebracht, also injiziert.
Mobile Phase auch Eluent, Fließmittel oder Laufmittel genannt.
Danach wandern die einzelnen Bestandteile der Probe ungleich schnell durch die Säule, weil sie durch Wechselwirkungen mit der stationären Phase unterschiedlich stark aufgehalten werden. Nach dem Austritt aus der Säule werden die einzelnen Stoffe von einem geeigneten Detektor erkannt und als Signal an die HPLC Software im Computer übergeben. Zum Ende dieses Vorganges / Laufes erhält man auf dem Computer in der HPLC Software ein Chromatogramm (Abb. 5) über das man die verschiedenen Stoffe identifizieren und quantifizieren kann.
Die HPLC hat sich inzwischen zu einer universell anwendbaren Methode entwickelt, so dass sie in nahezu allen Bereichen der Chemie, Biochemie und Pharmazie ihre Verwendung findet.
Typische Anwendungen der HPLC sind:
- Analyse von Arzneistoffen
- Analyse von synthetischen Polymeren
- Analyse von Schadstoffen in der Umweltanalytik
- Bestimmung von Wirkstoffen in biologischen Matrices
- Isolierung wertvoller Produkte.
- Reinheits- und Produktkontrolle von Industrieprodukten und Feinchemikalien
- Trennung und Reinigung von Biopolymeren, wie z.B. Enzymen und Nukleinsäuren
[Abb. 1]
[Abb. 2]
[Abb. 3]
[Abb. 4]
[Abb. 5]
2.0 HPLC Versionen
Es wird hauptsächlich zwischen isokratischer HPLC und Gradient HPLC unterschieden.
2.1 Bei einer isokratischen HPLC wird während eines Laufes nur mit einer Zusammensetzung des Eluenten gearbeitet. Das heißt die Wechselwirkung zwischen mobiler und stationärer Phase ist über die gesamte Zeit der Trennung konstant. Man kann damit vor allem ähnliche Substanzen gut trennen. Diese Art der Durchführung ist vor allem in der Routine besonders beliebt und sollte nach Möglichkeit für alle Trennaufgaben angestrebt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass man für diese Arbeitsweise nur eine Pumpe zur Förderung der Eluenten benötigt.
2.2 Bei einer Gradienten HPLC wird die Zusammensetzung des Eluenten kontinuierlich über die Zeit geändert. Man erreicht so eine stetige Änderung der Wechselwirkung zwischen Eluent und stationärer Phase. Die Probesubstanzen werden so schneller von den Austauschplätzen an der stationären Phase verdrängt. Man ist damit in der Lage auch Substanzkomponenten sehr unterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit zu trennen. Da bei dieser Arbeitsweise am Anfang einer Trennung eine andere Zusammensetzung des Eluenten vorliegt als am Ende muss man stets darauf achten, dass am Anfang einer Trennung das System im Gleichgewicht ist (=Equilibrierung). Die Mischung des Laufmittels kann gerätetechnisch auf verschiedene Arten durchgeführt werden.
2.2.1 Niederdruckgradienten
Die Mischung der verschiedenen Eluenten wird durch ein Proportionierventil vor dem Pumpenkopf durchgeführt und die Mischung mit der Pumpe durch die Anlage gefördert. Man spricht dann von einem Niederdruckgradienten. Die Mischung geschieht auf der Niederdruckseite (Normaldruck) der Anlage, also vor der Pumpe.
2.2.2 Hochdruckgradienten
Jeder Eluent wird von einer Pumpe gefördert und die Mischung erfolgt auf der Druckseite der Anlage. Dazu wird eine Mischkammer verwendet. Eine solche Anlage wird als Hochdruckgradienten HPLC bezeichnet. Bei der Förderung des Eluenten durch die HPLC-Anlage baut sich Druck auf. Den Hauptanteil bewirkt hierbei die Säule. Abhängig vom Trennmaterial, dessen Korngröße und Form, der Säulenlänge und des eingesetzten Eluenten (unterschiedliche Viskosität) ergeben sich Drücke bis ca. 300 bar und mehr.
3.0 Aufbau einiger HPLC Systeme
Eine HPLC besteht meistens aus fünf Hauptgeräten: Pumpe, Injektionseinheit, Trennsäule, Detektor mit Auswertesoftware und Fraktionensammler. Die HPLC verwendet Trennpartikel mit Korngrößen von 3 bis 20 µm, sie erreicht damit hohe Trennstufenzahlen, erfordert aber gleichzeitig die Überwindung eines relativ hohen Gegendrucks beim Transport der mobilen Phase durch die Trennsäule. Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander verbunden werden und druckstabil sein.
Analytische HPLC
Die analytische HPLC besteht meistens aus einer HPLC Pumpe mit Flussbereich von 0.01 – 10 ml/min, einem UV-Detektor, einem Probengeber (Autosampler) und einem PC mit analytischer HPLC Software.
Semipräparative HPLC
Die semipräparative HPLC besteht meistens aus einer HPLC Pumpe mit Flussbereich von 0.01 – 50 ml/min, einer Trennsäule, einem UV-Detektor, einem Fraktionensammler und einem PC mit präparativer HPLC Software.
Präparative HPLC
Die präparative HPLC besteht meistens aus zwei HPLC Pumpen mit Flussbereich von je 0.1 – 100 ml/min, einer Trennsäule, einem UV-Vis-Detektor, einem Probengeber/Fraktionensammler und einem PC mit präparativer HPLC Software.
4.0 HPLC Pumpen
4.1 Die HPLC Kolbenpumpe ist ein elektromechanisches Gerät zur Förderung der mobilen Phase (Eluent, Laufmittel) unter hohem Druck, bis ca. 600 bar. Im Pumpenkopf wird ein Kolben durch Dichtungen hin und her bewegt, wodurch der Eluent über das Einlassventil in den Kolbenraum gesaugt wird und über das Auslassventil in Richtung Trennsäule gedrückt wird (Abb. 6). Durch Verwendung von mehreren Pumpenköpfen kann eine pulsationsfreie Förderung des Laufmittels erfolgen, denn während der eine Kolben über das Einlassventil ansaugt stößt der andere Kolben das vorher angesaugte Laufmittel über das Auslassventil aus.
[Abb. 6]
4.2 Die HPLC Membranpumpe unterscheidet sich von der Kolbenpumpe dadurch, dass der Eluent nicht über einen Kolben sondern über die Bewegung einer Membrane gefördert wird. Wobei die Membrane durch die Hin- und Her-Bewegungen eines, in Öl befindlichem, Kolben in Bewegung versetzt wird und dadurch den Eluenten ansaugt und ausstößt, Kugelventile regeln auch hier den Weg der Flüssigkeit.
Dieser Pumpentyp wird hauptsächlich in industriellen präparativen HPLC-Anlagen eingesetzt.
5.0 Die Probenaufgabe
Die Probenaufgabe kann manuell mit einer Spritze über ein Ventil mit Probenschleife (Abb. 7) oder über einen Probengeber automatisch erfolgen (Abb. 8). Die Probe muss unter Umgebungsdruck in die unter Druck stehende Leitung der Anlage injiziert werden.
5.1 Bei der manuellen Probenaufgabe wird die Probe in eine Spritze aufgezogen und zunächst drucklos in eine Probenschleife injiziert, die sich an einem Mehrwege-Ventil befindet. Durch Umschalten des Ventils auf die Druckseite wird der Eluentenfluss durch die Probenschleife in Richtung Trennsäule geführt.
5.2 Bei der automatischen Probenaufgabe wird die Probe aus Gefäßen entnommen, die sich in einem elektronisch gesteuerten Gerät befinden, zum Beispiel in einem Autosampler. Über ein elektrisch betätigtes Ventil gelangt hier die Probe dann ebenfalls auf die Säule.
Einige Autosampler bieten die Möglichkeit zur Probenvorbereitung. Dazu gehören das automatisierte Verdünnen und Mischen der Probe und die Vorsäulenderivatisierung. Mit der geeigneten HPLC Software verdünnen die Geräte hoch konzentrierte Proben automatisch, sodass nach nur wenigen Injektionen die höchste Analysengenauigkeit erreicht und eine Überladung der Säule verhindert wird. Liegt die Konzentration außerhalb des kalibrierten Bereiches, werden diese Over-Range-Proben ebenfalls verdünnt, sodass ein erneutes Analysieren entfällt. Um die Analysenzeiten zu verkürzen, arbeiten einige Geräte mit der Sample-Overlap-Funktion. Während eine Probe noch aufgetrennt wird, erfolgt bei der nächsten schon die Vorbereitung. Das Mischen mit einem internen Standard, die Zugabe von Reagenzien oder das Herstellen von Standardlösungen und Kalibrierungen sind weitere mögliche Funktionen der Autosampler.
[Abb. 7]
[Abb. 8]
6.0 HPLC Säulen / HPLC Trennsäulen
Die HPLC Säulen bestehen üblicher Weise aus einem rostfreien Stahlrohr und Schraubkappen an beiden Enden mit einem Anschluss für eine Kapillare auf der einen Seite als Einlass und auf der anderen Seite als Auslass. Die HPLC Säulen sind mit der stationären Phase, einem sehr feinkörnigem, porösem Pulver (3, 5, 8 oder 10 µm Korngröße) unter mechanischem Druck, ohne Leerraum gefüllt. Je kleiner die Korngröße, desto höher ist die Trennleistung. Das Säulenmaterial wird immer nach der zu bearbeitenden Trennaufgabe ausgewählt. Die vermutlich am häufigsten verwendete HPLC Säule ist wohl eine „C18-Säule“. Die stationäre Phase ist in diesem Fall ein chemisch modifiziertes Kieselgel, auf dessen Oberfläche C18-Ketten aufgebaut sind. Um eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten sollte die HPLC Säule bei einer konstanten Temperatur betrieben werden. In der HPLC Säule werden die Probesubstanzen an der stationären Phase adsorbiert und durch Adsorptions/Desorptions Vorgänge getrennt.
Die analytische Trennsäule hat oft einen Innendurchmesser von 2 bis 5 mm und eine Länge von bis zu 250 mm, sie ist für einen max. Fluss von ca. 2 ml/min ausgelegt.
Die semipräparative Trennsäule mit einem Innendurchmesser von 10 – 50 mm und einer Länge von 250 mm ist für einen max. Fluss von ca. 100 ml/min geeignet.
Die präparative Trennsäule mit einem Innendurchmesser ab 75 mm und einer Länge von bis zu 1000 mm werden mit einem Fluss ab 100 ml/min verwendet.
Die Vorsäule wird direkt vor die Trennsäule montiert um deren Verschmutzung zu verhindern. Die Vorsäule ist kleiner und hat fast immer das gleiche Säulenmaterial wie die Trennsäule.
[Abb. 9]
6.1 Der Säulenpackstand „Säulen selber packen“
Möchte man bei der Trennsäule mit dem Säulenmaterial flexibel sein, so verwendet man einen Säulenpackstand oder auch Säulenpackstation genannt.
Dank statischer bzw. dynamisch-axialer Kompression können alle gängigen Säulenmaterialien in der vom Anwender gewünschten Bettlänge reproduzierbar gepackt werden.
Auf Grund des einfachen Packvorganges lässt sich die HPLC Säule schnell an die Bedürfnisse anpassen und es kann so auf eine Auswahl teurer Fertigsäulen verzichtet werden. Durch eine fest mit dem beweglichen Kolben verbundene Fritte kann das Trägermaterial mit hohen Drücken gepackt werden. Dadurch ist eine gleichmäßige Verteilung der Substanz über den ganzen Säulenquerschnitt und eine optimale Form der Peak‘s gewährleistet.
[Abb. 10]
Die Kompression des Säulenbettes kann auf zwei Arten erreicht werden. Entweder mit einer Platz sparenden Handhydraulik oder mit einer pneumatisch angetriebenen Hydraulik für statisch und dynamisch axiale Kompression. Bei der statischen Kompression kann die HPLC Säule dem Packstand entnommen werden. Somit können mehrere HPLC Säulen mit einem Packstand hergestellt werden. Wo hingegen bei der dynamisch axialen Kompression die HPLC Säule im Packstand verbleibt und das Säulenbett automatisch auf Pressung gehalten wird, damit am Säuleneingang kein Freiraum entstehen kann, der die Trennleistung beeinflussen könnte. Bei nachlassender Trennleistung der entnommenen HPLC Säule durch entstandenen Freiraum reicht ein Nachpressen aus, um wieder beste Trennergebnisse zu erzielen. Des Weiteren lassen sich mit einem Säulenpackstand unterschiedliche Bettlängen mit einem Säulenrohr realisieren und als Option ist bei einem Säulenrohr mit Thermomantel eine Temperierung über die gesamte Bettlänge möglich.
Der Packvorgang:
Der Bodenflansch wird am Säulenrohr montiert. Die Slurry (Emulsion aus Trägermaterial und geeignetem Lösungsmittel wie z.B. Isopropanol) wird in das Säulenrohr eingefüllt. Das Slurry (Säulenmaterial) wird hydraulisch gepresst, das Lösemittel der Slurry wird aus dem Säulenrohr verdrängt, so dass eine homogene feste Packung aus dem Packmaterial entsteht. Der Kolben wird fixiert (statische Kompression) oder automatisch gepresst (dynamisch axiale Kompression).
[Abb. 11]
7.0 HPLC Detektoren
Die HPLC Detektoren haben die Aufgabe, die in der Trennsäule getrennten und in der mobilen Phase stark verdünnten Probenmoleküle zu erfassen und an die HPLC Software im Computer weiter zu geben.
7.1 Der UV-Detektor ist z.Zt. der am häufigsten in der HPLC verwendete Detektor. Hierbei wird UV-Licht, von einer Deuterium- oder Quarz-Lampe im Detektor mit einer bestimmten Wellenlänge durch eine Durchflusszelle gestrahlt. Dahinter auf einer Fotodiode aufgefangen (Abb. 12) und als elektrisches Signal an die HPLC Software weitergegeben. Der UV-Detektor misst mit einer Fotomesszelle an der Durchflusszelle ständig die Extinktion des Lichtes nach Durchdringung des Laufmittels, mit den Probenmolekülen, welches in konstantem Abstand zweier Glasscheiben hindurch fließt. Die Abschwächung der Strahlung (Extinktion)und somit die Änderung des elektrischen Signales, ändert sich daher nur noch durch die Konzentration und die Art des Mediums. Da Eluent und Probe das Licht unterschiedlich absorbieren ergibt sich ein veränderndes elektrisches Signal. Diese Änderungen werden als Substanz-Peak in der HPLC Software angezeigt. Das Chromatogramm setzt sich meistens aus mehreren Peaks zusammen.
Nachweisgrenze ca. 0.3 ng/ml
[Abb. 12]
7.2 Der Dioden-Array Detektor (DAD) oder auch Photo-Dioden-Array-Detector (PDA) genannt, misst genau wie der UV-Detektor eine Lichtabsorption durch die mobile Phase im ultravioletten bzw. visuellen Wellenlängenbereich. Jedoch erfolgt die Wandlung in das elektrische Messsignal nicht durch eine Fotomesszelle, sondern meist durch 512 oder 1024 Fotodioden die zu einer quadratischen Fläche angeordnet sind, dem Dioden-Array. Damit gelingt es den gesamten Spektralbereich, also mehrere Wellenlängen gleichzeitig zu erfassen.
Nachweisgrenze ca. 0.3 ng/ml
7.3 Der Brechungsindex Detektor (RI = Refractive Index Detektor) ist unempfindlicher als der UV-Detektor, aber er kann Substanzen erkennen die keine UV-Absorbtion zeigen. Er misst den Unterschied des Brechungsindexes zwischen reinem Laufmittel und mit Probe vermischtem Laufmittel. Zur Messung benötigt der RI-Detektor allerdings immer einen Referenzkanal mit reiner mobiler Phase. Je stärker sich die Brechungsindices von mobiler Phase und Referenzsubstanz unterscheiden, umso größer ist das Signal an das Chromatogramm für den Substanz-Peak. Verwendung findet er hauptsächlich in der Polymerchemie und in der Zuckeranalytik.
Nachweisgrenze ca. 0.7 µg/ml
7.4 Der Fluoreszenz Detektor (FLD = Fluorescence Detector) ist bis zu 1000 mal sensitiver als der UV Detektor. Er nutzt die Eigenschaft von fluoreszierenden Stoffen diese zu detektieren.
Nachweisgrenze ca. 0.8 pg/ml
7.5 Der Elektrochemische Detektor (ECD = Electron Capture Detector) oxidiert oder reduziert durch Anlegen eines Potentials die Substanzkomponenten. Die Veränderung des Potentials zeigt das Vorhandensein einer Substanzkomponente an. Sein Einsatzgebiet ist hauptsächlich die klinische Chemie.
Nachweisgrenze ca. 1.0 pg/ml
7.6 Der Lichtstreu Detektor (ELSD = Evaporative Light Scattering Detector) kommt zum Einsatz wenn Stoffklassen, wie z.B. Lipide, Kohlenhydrate, Polymere, Tenside, Aminosäuren, nicht oder nur in geringem Maße UV oder VIS-aktiv sind. Er ist in der HPLC und GPC sehr gut als Universaldetektor geeignet, da er ein physikalisch anderes Detektionsprinzip verwendet. Der Eluentenstrom wird mit Druckluft/Stickstoff vernebelt und in einer Trocknungseinheit aus Glas verdampft. In den daraus resultierenden Aerosolpartikeln werden die Analyten massenselektiv über Lichtstreuung gemessen. Dieses Detektionsprinzip erlaubt im Gegensatz zum RI-Detektor und elektrochemischen Detektor (ECD) die Verwendung von Eluenten Gradienten. Die Lichtstreutechnik ermöglicht höchste Sensitivität und driftfreie Detektion ohne umständliche Einstellungsprozeduren.
Nachweisgrenze ca. 5 ng/Probenkomponente
8.0 Fraktionensammlung
Damit Ihnen keine wertvollen Substanzen nach erfolgreicher Trennung verloren gehen, dafür sorgt ein Fraktionensammler. Neben tropfen- und volumenabhängigem Sammeln ist vor allem das Fraktionieren über Zeitabschnitte, Zeitfenster und/oder Peak-Erkennung sehr hilfreich. Optionale Ventile sorgen für ein kontaminationsfreies Sammeln in die einzelnen Gefäße. Verschiedenste Rackformate von Mikrotiterplatten bis Großvolumina erlauben meist einen weiten Einsatzbereich. Oftmals können Programme gespeichert und über die HPLC Software automatisch abgerufen werden. Die Software ermöglicht über ein integriertes Sampletracking eine genaue Zuordnung Ihrer Fraktionen zu den, in den Chromatogrammen aufgezeichneten Sammelereignissen sowie die Dokumentation der Fraktionierungen.
[Abb. 13]
9.0 HPLC Software
Zur Steuerung der Anlage und zur Auswertung der Messergebnisse wird meistens ein Computer mit einer HPLC Software (Abb. 14) verwendet. Für die qualitative Analyse werden nur alle Peaks, welche in Ihrer Probe enthalten sind getrennt (Fraktionierung). Bei der quantitativen Analyse muss die genaue Konzentration oder Menge, der in der Probe vorhandenen Substanzen bekannt sein. Dann lässt sich auch die Auswertung über die Fläche der Peaks durchführen.
[Abb. 14]
9.1 Das Chromatogramm
In Abhängigkeit von der Art des Detektors erhält man ein differentielles Chromatogramm (Abb. 15) oder integrales Chromatogramm, wobei das integrale Chromatogramm sehr selten ist. Den Teil des Chromatogramms, der vom Detektor aufgezeichnet wird, wenn nur die mobile Phase eluiert wird, bezeichnet man als Basislinie oder Grundlinie. Als Peak bezeichnet man den Detektorausschlag für einen Analyten. Bei unvollständiger Trennung können sich unter dem Peak auch mehrere Substanzen verbergen. Die Interpolation der Basislinie zwischen Anfang und Ende des Peaks bezeichnet man als die Basis des Peaks. Die Peakfläche wird vom gesamten Signal des Peaks umschlossen. Das Peakmaximum stellt den Extremwert des Detektorsignals dar, die Peakhöhe gibt den Abstand des Maximums von der Grundlinie des Peaks wieder.
[Abb. 15]
Wir hoffen dass die Informationen für Sie interessant und vielleicht auch hilfreich für Ihre Tätigkeit sind.
Freundliche Grüße
Ihre O-CP GmbH
Quelle: Handbuch der HPLC, K.K. Unger, GIT Verlag